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脂质体载体用于直接体内基因转染实验

脂质体载体用于直接体内基因转染实验

 

用于组织培养物中的细胞的脂质体转染的许多阳离子脂质体都能够购买得到。成分优化高度依赖细胞类型,而与在进行体内转染相对应组织时,典型的优化的成分不相关。所以,对于体外的转染,建议读者在说明书的指导下测试不同的商业脂质体。

1.用CH3Cl3将 30.0ml 的透紫外灯玻璃管漂洗 3 次。

2.混匀用于准备脂质体的在透紫外灯玻璃管中的适当的脂质。

1)对于 DC-Chol/DOPE 的脂质体(摩尔比 3:2): 加入1.07ml DC-Chol 储存液 和 0.1 ml DOPE 储存液,来回漩涡振荡混匀。

2)对于DOTAP/cholesterol 脂质体(摩尔比为 1:1): 加入 1.0ml DOTAP 储存液和 0.55 ml 胆固醇储存液,来回漩涡振荡混匀。

3.用手旋转管子,同时通过沿着管壁吹氮气,蒸发CH3Cl3,形成薄的脂质薄膜。

4.在真空干燥器中干燥 2~3 h,使膜完全干燥。为了避免在真空环境下脂质膜的丢失,用铝箔在管口盖住,并在铝箔上面用 26-G1/2 的针戳一些小洞。

5.加 2.Oml 5.2% 的葡萄糖溶液到膜上。

6.旋转管子将脂质重悬直至差不多所有的脂质膜都重悬在溶液中。

脂质可能存留在管壁上,以白色固体沉淀出现。在水浴超声破碎仪中处理几次将帮助溶解脂质到溶液中

7.将悬液室温放置 2~3 h 或者 4°C 过夜,让脂质完全水合。用石蜡膜封住。在 65℃的水浴箱中加热悬液 5~10min。

8.为了使脂质凝聚物弥散,将脂质溶液置于水浴超声破碎仪中进行超声处理直到所有的凝聚物都消失,然后放回水浴。

9.将两个 1.0um 聚碳酸酿膜滤器放在挤压机中,加热挤压机到 65°c,5 min。

10.通过将悬液通过挤压其 10 次,挤出脂质分散物。挤压后置水浴。

   悬液压缩处理后,应该由不透明的混浊的溶液变成透明而混浊的悬液。

11.用 0.4um 和 0.1um 的聚碳酸酯膜滤纸,重复第 9~10 步,从而得到小的单层的脂质体,直至为 100~200nm。将脂质体储存在 4°C(可至 12 个月)。

这些脂质体随时可以用于与 DNA 混合用于基因转染。

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