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蛋白质含游离巯基上的定点修饰

 

 

蛋白质含游离巯基上的定点修饰

对蛋白质药物中含有的游离巯基,可用呈一定反应活性的聚乙二醇衍生物,如聚乙二醇–马来酰亚胺(PEG-MAL)对其进行定点修饰,得到预期产物。对巯基进行聚乙二醇化的试剂还有聚乙二醇–邻吡啶二硫醚(PEG-OPSS),聚乙二醇–乙烯基砜(PEG-VS)等,此外,还有新近研究的聚乙二醇–硒(PEG-Se)试剂和聚乙二醇–多巴醌(PEG-DAQ)。

 

1.1 聚乙二醇马来酰亚胺修饰巯基

 

人血浆白蛋白(HSA)是一种含 585 个氨基酸残基的单链无糖基化蛋白质,是人血浆中zui丰富的蛋白质,约占血浆总蛋白的 60%,在人体内具有维持血容量和血液胶体渗透压等重要physiological function是临床上常用的一种天然血液制品,主要用于zhi liao失血、shao shang及创伤等引起的休克、脑水肿、大脑损伤所致的颅内压升高,以及低蛋白血症和肝硬化或nephropathy引起的水肿和腹水。但shao shang、感染或手术等某些病理条件下,mao xi xue guan通透性增加,导致 HSA 向血管外泄漏,且从血管渗出的 HSA 常在敏感组织聚集,从而加重或引起组织水肿。另外,HSA 适应症广泛,且用量大(每个患者每天 HSA 用量达几克),拥有巨大的市场需求量。但近年来,由于血液来源紧张等原因致使 HSA 供应十分紧张,如何解决当前白蛋白紧缺的问题成为目前白蛋白研究的热点。

 

对蛋白质药物中含有的游离巯基可用呈一定反应活性的聚乙二醇衍生物,如聚乙二醇–马来酰亚胺(PEG-MAL)对其进行定点修饰,得到预期产物,见图 1。针对以上人血白蛋白来源短缺及在某些病理条件下大量输注血管保留率低,易引起或加重组织水肿的问题,采用线性或支链型的马来酰亚胺活化的 PEG 20000 共价连接到白蛋白分子上游离半胱氨酸(Cys-34)位点上,制成 PEG 修饰的 HSA 样品,增大白蛋白的相对分子质量,赋予白蛋白分子较大的水化体积,从而减少 HSA 分子透过血管内皮细胞间隙进入周围组织,提高 HSA 的血管保留率,减少其引起组织水肿的副反应。PEG-HSACD 光谱与 HSA 的极为相似,二者的二级结构基本相同,提示定点 PEG 修饰并未影响 HSA 的二级结构。小鼠体内的药动学研究结果显示 PEG-HSA 的血浆半衰期延长为原来的 2.2 倍,同时总体清除率和稳态分布体积有所降低。在急性肺损伤实验中测得每克肺组织中透过血管的白蛋白为(0.057±0.017)mmol,而 PEG-HSA 的透过量仅为(0.034±0.007)mmol,两者比较差异有统计学意义(P0.05),提示聚乙二醇修饰的人血清白蛋白能改善人血清白蛋白的药动学性质,延长人血清白蛋白的体内半衰期,聚乙二醇的高黏性和高渗性分别有助于増加微血管的灌注和减轻肺部缺血再灌注损伤,在血管透过率增加的炎症条件下能显著提高白蛋白的血管保留率,有助于白蛋白发挥其扩充血容量的药理作用,有望成为一种优良的血容量扩充药。

 

 

 

1.2 聚乙二醇硒试剂修饰巯基

 

Kunstelj 等报道了一种可以选择性修饰自由巯基的聚乙二醇化试剂,由线性聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(PEG-NHS)和硒基半胱胺连接生成, PEG-Se 试剂的合成路线见图 2。该反应速度很快,转换率可达 95%。这种新的 PEG-Se 试剂的活性基团是二硒键,通过巯基/二硒键交换和巯基反应。以18位含有未成对半胱氨酸的重组人粒细胞集落刺激因子(Cys18-rhG-CSF)为模型蛋白,用 PEG-Se 试剂和商品化的 PEG 化试剂(PEG-MAL、PEG-OPSS)做聚乙二醇化对比实验,发现聚乙二醇化产率zui高的是 PEG-MAL,其次是 PEG-OPSS 和 PEG-Se; PEG-MAL 和PEG-Se 的反应速度相当,而 PEG-OPSS的反应速度很慢。将 PEG-rhG-CSF 结合物纯化后做了表征和比较,尽管所有的结合物都含有连在 Cys18 上的 PEG 20000,但活性、稳定性及体内表现都各不相同。用 PEG-MAL 生成的结合物有微小的构象变化,这些变化也反映在低体外活性和马来酰亚胺结合物的聚集态上。PEG-Se 试剂制备的结合物体外活性zui高,而 PEG-OPSS 试剂制备的结合物体内Best performance。

 

 

 

1.3 聚乙二醇多巴醌试剂修饰巯基

 

Xu 等描述了一种基于儿茶酚衍生的反应性醌的巯基上进行聚乙二醇定点修饰的方法。儿茶酚衍生的聚乙二醇由线性聚乙二醇琥珀酰亚胺(PEG-NHS)和多巴胺偶联后氧化得到聚乙二醇多巴醌(PEG-DAQ),PEG-DAQ 用于修饰两种模型蛋白,即截短鞭毛蛋白(CBLB502)和人重组睫状节神经细胞营养因子(rhCNTF)上的半胱氨酸,证实了它的巯基特异性,在中 pH 值条件下,PEG-DAQ-rhCNTF 的收率为 87.5%,而 PEG-MAL 和PEG-VS 的收率分别为 92.3%、17.6%,在含水溶剂中孵育 96 h 后,PEG-DAQ 保留了大约 95%的反应活性,说明试剂在水中稳定性好,而且聚乙二醇化反应必须用过量的半胱氨酸来淬灭才能得到更多稳定的结合物,所得到的 PEG-DAQ-rhCNTF 在存放14d后保持了 93.5%的活性,而 PEG-MAL-rhCNTF只有 71.2%。这些结果表明,PEG-多巴醌具有高度选择性和半胱氨酸巯基反应性,试剂本身和偶联产物稳定性好,是巯基选择性修饰的良好试剂。

 



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